緊張素Ⅱ 1 型受體拮抗劑對(duì)小鼠腎臟的保護(hù)作用機(jī)制。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性 SD 大鼠 18 只, 體重 180±20g , 在溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng), 人工光照, 陰暗各 12h, 自由飲食。 動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(浙)2005-0061 。
1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 纈沙坦膠囊(北京諾華制藥公司, 藥準(zhǔn)字 H20040217);Ang Ⅱ 放elisa免試劑盒;鼠抗人 TG F-β1 、a-SM A 單克隆抗體;山羊抗鼠 IgG抗體;免疫組化檢測(cè)試劑盒、DA B顯色劑。
1.3造模與分組 模型制作:用 3 戊巴比tuo鈉按 0.15mL· kg -1 的劑量麻醉大鼠后, 行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。 步驟:背部肋脊角處做一縱行切口, 長(zhǎng)約 2～ 3cm(與背部正中線平行), 夾住脂肪組織 , 取出腎臟, 將其翻向脊柱側(cè), 以生理鹽水紗布覆
2
結(jié)果
M asson 染色顯示假手術(shù)組腎臟未見明顯病變(見圖 1A , 表 1);U UO 術(shù)后第二十八天, 梗阻側(cè)腎組織腎小管間質(zhì)大部分已纖維化(見圖 1B, 表 1), U U O 組與假手術(shù)組比較有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P <0.01 ;纈沙坦組部分近端小管上皮細(xì)胞空泡變性, 管腔內(nèi)可見脫落壞死的上皮細(xì)胞, 遠(yuǎn)端腎小管擴(kuò)張。 但是纖維化程度較 U UO 組輕(見圖 1C , 表 1), 二者比較有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P <0.01 。免疫組化顯示假手術(shù)組大鼠腎間質(zhì)只有極少量的 T GF-β1 、α-SM A 陽(yáng)性表達(dá)(見圖 1D 、圖 1G , 表 1), 模型組大鼠 TG F-β1 、α-SMA 陽(yáng)性表達(dá)與假手術(shù)組比較顯著增多(見圖 1E、圖 1H , 表 1)(P <0.01);纈沙坦組 TGF-β1 、α-SM A 陽(yáng)性表達(dá)也較模型組明顯減少(見圖 1F 、圖 1I , 表 1)(P <0.01)。
表 1 3 組病理 M ASSON 染色以及Ang Ⅱ 、TG F-β1 和α-SM A 比較
蓋, 暴露腎蒂, 分離出輸尿管, 12 只在中 2/ 3 與下 1/ 3 處, 用 0
號(hào)線上下結(jié)扎兩次, 中間剪斷輸尿管。 提起切口處皮膚肌肉,
組別 纖維化指數(shù)
Ang Ⅱ (ng·L -1)
α-SM A
(陽(yáng)性 )
TG F-β 1
(陽(yáng)性 )
使腎臟回納原位, 分層縫合肌肉、皮膚層, 隨機(jī)分為模型組予以生理鹽水 1 日 1mL 灌胃;纈沙坦組為成人單位劑量的 10
倍(給藥量為 12mg/ (K g·d) ;假手術(shù)組 6 只:剖開大鼠腹腔,
分離出左側(cè)輸尿管后, 不結(jié)扎, 分層縫合, 予以生理鹽水 1 日
1mL 灌胃。 療程 1 個(gè)月。
1.4指標(biāo)檢測(cè) 在 U U O 術(shù)后治療 4 周, 處死全部大鼠, 腹主動(dòng)脈采血分離血漿,-80℃冰箱保存。 采用放射免疫分析法測(cè)定血漿 Ang Ⅱ 水平, 取凍存全部血漿標(biāo)本, 嚴(yán)格按照上海勁馬生物科技有限公司 Ang Ⅱ 放免試劑盒說明書冰浴下檢測(cè)血漿Ang Ⅱ 水平。 所有標(biāo)本均同批檢測(cè)。 取術(shù)側(cè)腎組織置于10 福爾馬林固定液中, 石蠟包埋切片, 行 M asson 染色觀察腎小管間質(zhì)病變, 免疫組化染色觀察 a-SM A 及 T GF-β1 在腎間質(zhì)的表達(dá), 并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。
1.5病理觀察 腎組織 M asson 染色, 光鏡觀察。 在 PAS- 9000 高清晰度數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)下計(jì)算腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)。 高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取 6 個(gè)不重疊視野測(cè)定小管間質(zhì)纖維化面積與同視野小管間質(zhì)總面積的百分比, 進(jìn)
行半定量評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0 分:無(wú)病變;1 分:<25 ;2 分: 26 ～ 50 ;3 分:>50 。 每張切片取 6 個(gè)視野的平均積分, 再在各組取平均值。
1.6免疫組織化學(xué)檢測(cè) 免疫組化 T GF-β1 、a-SM A 采用 A BC 法:石 蠟切片脫蠟, 水化后, 用 0.075 胰酶于 37 ℃, 15min 或采用微波進(jìn)行抗原修復(fù), 一抗工作濃度為 1∶600 ～ 1000。 應(yīng)用 DAB(二氨基聯(lián)苯胺)顯色。 常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片, 鏡檢, 在 400 倍光鏡下觀察、記錄免疫組化結(jié)果, 棕黃色為陽(yáng)性染色。 在每張切片不包含腎小球和血管的間質(zhì)區(qū)域隨機(jī)選取 20 個(gè)高倍鏡視野(X200, HPF), 用 Niko n E- clipse 80i Nis-Elements image softmare 分析系統(tǒng)對(duì)所選取視野中免疫組化陽(yáng)性信號(hào)進(jìn)行圖像分析 , 計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性染色面積占總視野面積的百分比。
1.7統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x ±s)表示, 多組間比較采用單因素方差分析(one-w ay ANO VA), 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均由 SPSS 16.0 軟件完成, P <0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
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